附件：應(yīng)用于結(jié)直腸癌輔助診斷的微小核糖核酸（microRNA）檢測試劑非臨床研究審評要點（2025年第15號）.doc

應(yīng)用于結(jié)直腸癌輔助診斷的微小核糖核酸
（microRNA）檢測試劑非臨床研究
審評要點

本審評要點主要針對應(yīng)用于結(jié)直腸癌輔助診斷的微小核糖核酸（microRNA）檢測試劑的分析性能、陽性判斷值、穩(wěn)定性、主要原材料和生產(chǎn)工藝等研究過程，為體外診斷試劑注冊申請人和技術(shù)審評部門提供參考。

本審評要點是對應(yīng)用于結(jié)直腸癌輔助診斷的microRNA檢測試劑的一般要求，申請人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用。若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內(nèi)容進(jìn)行充實和細(xì)化。

本審評要點是供注冊申請人和技術(shù)審評人員使用的指導(dǎo)性文件，但不包括審評審批所涉及的行政事項，亦不作為法規(guī)強制執(zhí)行，應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本審評要點。如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細(xì)的研究資料和驗證資料。

本審評要點是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，相關(guān)內(nèi)容也將適時進(jìn)行調(diào)整。

一、適用范圍

本要點適用于采用實時熒光PCR法，對人糞便樣本中的微小核糖核酸（microRNA）進(jìn)行體外定性檢測的試劑。臨床用于對結(jié)直腸癌疑似患者的輔助診斷，不用于普通人群的腫瘤篩查。

二、注冊審查要點

（一）監(jiān)管信息

1.產(chǎn)品名稱及分類編碼

產(chǎn)品名稱應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》（國家市場監(jiān)督管理總局令第48號）及相關(guān)法規(guī)的要求，如微小核糖核酸（microRNA）檢測試劑盒（熒光PCR法）。根據(jù)《體外診斷試劑分類規(guī)則》，該產(chǎn)品按照第三類體外診斷試劑管理，分類編碼為6840。

2.其他信息還包括產(chǎn)品列表、關(guān)聯(lián)文件、申報前與監(jiān)管機構(gòu)的聯(lián)系情況和溝通記錄以及符合性聲明等文件。

（二）綜述資料

綜述資料主要包括概述、產(chǎn)品描述、預(yù)期用途、申報產(chǎn)品上市歷史及其他需說明的內(nèi)容。建議以圖文結(jié)合的形式詳細(xì)說明產(chǎn)品所采用的技術(shù)原理及檢測流程，包括但不限于RNA提取、反轉(zhuǎn)錄前處理、反轉(zhuǎn)錄引物設(shè)計（如莖環(huán)結(jié)構(gòu)等）、擴增引物探針設(shè)計原理等。如試劑盒中存在防污染體系，應(yīng)進(jìn)行說明。對于陽性判斷值需計算后進(jìn)行判讀的產(chǎn)品，應(yīng)詳述計算原理、模型選擇和判讀規(guī)則。與已上市同類產(chǎn)品進(jìn)行比較，比較內(nèi)容包括樣本類型、檢測原理、檢測靶基因、判讀規(guī)則、分析性能和臨床性能等。

預(yù)期用途中明確產(chǎn)品檢測的基因。詳述基因選擇標(biāo)準(zhǔn)及選擇過程，提供相關(guān)指南或文獻(xiàn)；同時提供文獻(xiàn)中待檢基因在其他腫瘤中的表達(dá)情況，并分析所檢測基因的靈敏度和特異性是否符合臨床需求。

如為多靶標(biāo)檢測產(chǎn)品，應(yīng)分析多靶標(biāo)檢測的靈敏度和特異性是否符合臨床需求。

明確產(chǎn)品預(yù)期人群，例如年齡和體征等指標(biāo)。

（三）產(chǎn)品技術(shù)要求及檢驗報告

注冊申請人應(yīng)當(dāng)在原材料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的前提下，根據(jù)產(chǎn)品研制、前期評價等結(jié)果，依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及有關(guān)文獻(xiàn)資料，結(jié)合產(chǎn)品特性按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則》（2022年第8號）的要求編寫。該類產(chǎn)品作為第三類體外診斷試劑，應(yīng)當(dāng)以附錄形式明確主要原材料（包括企業(yè)參考品）以及生產(chǎn)工藝要求。

如有國家標(biāo)準(zhǔn)品，技術(shù)要求中應(yīng)體現(xiàn)國家標(biāo)準(zhǔn)品的相關(guān)要求，并使用國家標(biāo)準(zhǔn)品對三批產(chǎn)品進(jìn)行檢驗。

如有適用的國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，產(chǎn)品技術(shù)要求的相關(guān)要求應(yīng)不低于相應(yīng)的要求。

（四）分析性能研究

注冊申請人應(yīng)采用在符合質(zhì)量管理體系的環(huán)境下生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行所有分析性能研究，提交具體研究方法、試驗方案、試驗數(shù)據(jù)、統(tǒng)計分析等詳細(xì)資料。

如果試劑適用不同的機型，需要在不同機型上分別進(jìn)行分析性能評估。應(yīng)采用一個或多個機型，進(jìn)行充分的試劑分析性能建立研究，對于其他機型，應(yīng)分析各適用機型的工作原理、檢測方法、反應(yīng)條件控制、信號處理等，如基本相同，可基于風(fēng)險分析對已建立的分析性能指標(biāo)進(jìn)行合理驗證。所有適用機型驗證的分析性能應(yīng)基本一致，如不同機型對某一檢測項目的某一分析性能存在差異，應(yīng)針對該差異采用不同機型進(jìn)行充分的分析性能建立研究。

如申報產(chǎn)品包含不同包裝規(guī)格，需對各包裝規(guī)格間的差異進(jìn)行分析或驗證。如不同規(guī)格間存在性能差異，需采用每個包裝規(guī)格產(chǎn)品進(jìn)行分析性能評估；如不同規(guī)格間不存在性能差異，需要詳細(xì)說明各規(guī)格間的差別及可能產(chǎn)生的影響，采用具有代表性的包裝規(guī)格進(jìn)行分析性能評估。

分析性能評估所用樣本應(yīng)盡量與預(yù)期適用的真實臨床樣本一致。如特定低濃度的樣本難以獲得，可采用不同濃度的樣本及陰性樣本進(jìn)行混合研究；必要時，如使用人工基質(zhì)進(jìn)行稀釋，應(yīng)考慮其基質(zhì)效應(yīng)。應(yīng)提供樣本基本信息，如樣本來源、樣本類型、稀釋方式、定值過程及數(shù)據(jù)等。

建議著重對以下分析性能進(jìn)行研究。

1.反應(yīng)體系

1.1樣本采集和處理

根據(jù)適用樣本類型，進(jìn)行樣本采集研究。提供樣本采集器具和保存液等的詳細(xì)研究資料，對配套的每種保存液均需驗證檢出限和重復(fù)性。

1.2核酸提取、反轉(zhuǎn)錄和擴增反應(yīng)體系

研究確定最佳核酸提取、反轉(zhuǎn)錄和擴增反應(yīng)體系，包括核酸提取方法與過程、提取用樣本體積/重量、洗脫體積、RNA濃度、DNA去除（如有）、反轉(zhuǎn)錄和擴增模板量、酶用量（如有）/各種試劑加樣體積及反應(yīng)各階段溫度、時間、循環(huán)數(shù)等。

提交不同適用機型基線和閾值循環(huán)數(shù)的確定資料。

不同適用機型的反應(yīng)條件如果有差異應(yīng)分別詳述，并提交驗證資料。

2.樣本穩(wěn)定性

對采集后各階段的樣本進(jìn)行穩(wěn)定性研究，研究內(nèi)容包括保存條件、保存時間，凍融次數(shù)等。建議對每種保存液均進(jìn)行穩(wěn)定性研究。

如核酸提取產(chǎn)物或反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可不立即進(jìn)行檢測，還需對核酸提取產(chǎn)物或反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的保存條件和穩(wěn)定性進(jìn)行研究。

3.樣本適用性

產(chǎn)品適用的樣本類型為人糞便樣本。建議根據(jù)布里斯托（Bristol）大便分類法收集主要型別的糞便樣本及其他可能影響檢測結(jié)果的糞便樣本類型（如黏液便、膽汁便），分別進(jìn)行研究。對不適用糞便類型應(yīng)在說明書明示。

4.核酸提取/純化性能

糞便樣本中存在大量干擾物質(zhì)。核酸提取/純化步驟的目的除最大量分離出RNA外，還有相應(yīng)的純化作用，應(yīng)盡可能去除PCR抑制物。對配合使用的所有核酸提取試劑進(jìn)行提取核酸純度、濃度、提取效率的研究。若產(chǎn)品適用兩種或以上核酸提取試劑，則每一種核酸提取試劑均需配合檢測試劑進(jìn)行抗干擾、重復(fù)性和檢出限的驗證。

5.準(zhǔn)確度

建議采用申報試劑與已上市產(chǎn)品或其他對比方法同時檢測臨床樣本比較檢測結(jié)果之間的一致性程度。研究應(yīng)包括一定數(shù)量的陰性、陽性樣本，并納入不同病理分期樣本和干擾樣本。

6.精密度

采用三批試劑對可能影響檢測精密度的主要變量進(jìn)行驗證，應(yīng)考慮運行、時間、操作者、儀器、試劑批次和試驗地點等影響精密度的條件，設(shè)計合理的精密度試驗方案進(jìn)行評價。精密度評價試驗應(yīng)包含核酸提取步驟。

應(yīng)至少包含3個水平：陰性樣本、弱陽性樣本、中/強陽性樣本，并根據(jù)產(chǎn)品特性設(shè)定適當(dāng)?shù)木芏纫螅纾?/p>

陰性樣本：樣本檢測結(jié)果均應(yīng)為陰性。

弱陽性樣本：結(jié)直腸癌患者樣本，待測物濃度為試劑盒陽性判斷值對應(yīng)的靶基因濃度，靶基因Ct值的CV≤5%。

中/強陽性樣本：結(jié)直腸癌患者樣本，待測物濃度呈中度到強陽性，陽性檢出率為100%且靶基因Ct值的CV≤5%。

7.分析特異性

7.1交叉反應(yīng)

7.1.1生物信息學(xué)分析

采用生物信息學(xué)分析方法進(jìn)行研究，應(yīng)當(dāng)包括人基因組、糞便常見microRNA和糞便微生物組。

7.1.2 樣本驗證

樣本基質(zhì)應(yīng)與預(yù)期檢測樣本類型一致，交叉反應(yīng)研究用樣本主要考慮以下幾方面：

其他惡性腫瘤患者尤其是其他部位消化道惡性腫瘤患者（如食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、膽管癌等）糞便樣本、消化道良性疾病患者（如炎癥性腸病、消化性潰瘍、結(jié)直腸腸息肉等）糞便樣本；

其他糞便常見microRNA、待檢基因同源基因或待測靶標(biāo)的相似序列microRNA。

7.2干擾研究

應(yīng)根據(jù)所采集樣本類型，針對可能存在的內(nèi)源/外源物質(zhì)干擾情況進(jìn)行驗證。建議申請人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進(jìn)行試驗，采用至少包含弱陽性水平在內(nèi)的樣本。對結(jié)果進(jìn)行合理的統(tǒng)計分析，對比添加干擾物質(zhì)前后的 Ct 值差異；如為多靶標(biāo)檢測產(chǎn)品，還應(yīng)比較綜合計算后的結(jié)果差異。檢測的潛在干擾物包括樣本中的原有物質(zhì)及在樣本采集和處理期間引入的物質(zhì)。

常見內(nèi)源性干擾物質(zhì)：血紅蛋白、膽紅素、白細(xì)胞、血清白蛋白、多糖等。

常見外源性干擾物質(zhì)：維生素C、膳食纖維、消化道疾病常用藥物（通便靈、西咪替丁等H2受體拮抗劑；奧美拉唑等質(zhì)子泵抑制劑、硫糖鋁等胃黏膜保護(hù)劑；乳酸桿菌等胃腸道益生菌、嗎丁啉等促胃腸動力藥、胰酶等消化酶補充劑）。

8.檢出限

8.1檢出限的確定

將不同來源的至少3個樣本梯度稀釋于與適用樣本一致的基質(zhì)中，進(jìn)行檢出限的確定。每個濃度梯度最少重復(fù)3次檢測，以100%可檢出的最低濃度水平作為估計檢出限，在此濃度附近制備若干梯度濃度樣本，每個濃度至少重復(fù)20次檢測，將具有95%陽性檢出率的最低濃度水平作為確定的檢出限。

8.2檢出限的驗證

選擇另外3個不同來源的樣本在檢出限濃度水平進(jìn)行驗證，應(yīng)達(dá)到95%陽性檢出率。

如包括多個檢測靶標(biāo)，應(yīng)分別進(jìn)行研究。

9.企業(yè)參考品驗證

根據(jù)主要原材料研究資料中的企業(yè)參考品設(shè)置情況，采用三批產(chǎn)品對企業(yè)參考品進(jìn)行檢驗并提供詳細(xì)的試驗數(shù)據(jù)。

（五）穩(wěn)定性研究

申報試劑的穩(wěn)定性主要包括實時穩(wěn)定性（有效期）、使用穩(wěn)定性、運輸穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制等研究，申請人可根據(jù)實際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括具體的實施方案、詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)以及統(tǒng)計分析結(jié)論。對于實時穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批產(chǎn)品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

（六）陽性判斷值研究

單靶標(biāo)檢測的申報產(chǎn)品，陽性判斷值一般為申報產(chǎn)品檢測靶標(biāo)陽性的Ct值。如申報產(chǎn)品需通過多個靶標(biāo)計算后進(jìn)行判讀，申請人應(yīng)詳述計算模型選擇依據(jù)、計算過程、權(quán)重系數(shù)等。

陽性判斷值研究用樣本來源應(yīng)具有多樣性和代表性，考慮不同時間、地域、不同的生理狀態(tài)等因素。應(yīng)根據(jù)結(jié)直腸癌輔助診斷的預(yù)期用途，納入相關(guān)預(yù)期人群，包括不同病理分期的結(jié)直腸癌患者、不同種消化道良/惡性腫瘤疾病干擾樣本，并盡量納入較多弱陽性和高陰性水平的樣本。采用ROC曲線分析建立陽性判斷值，并確定產(chǎn)品的判讀規(guī)則。如判定值存在灰區(qū)，應(yīng)提供灰區(qū)的確認(rèn)資料。

提交陽性判斷值研究所用樣本的背景信息列表，至少包括性別、年齡、臨床診斷信息、樣本來源機構(gòu)、檢測結(jié)果等信息。

提供內(nèi)標(biāo)檢測結(jié)果范圍的確定方法和研究資料。

（七）其他非臨床研究資料

1.主要原材料研究

該類產(chǎn)品的主要原材料包括引物、探針、酶、dNTP、核酸分離/純化組分（如有）、質(zhì)控品、企業(yè)參考品等。應(yīng)提供主要原材料的選擇與來源、制備過程、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)研究資料、質(zhì)控品的定值試驗資料等。如主要原材料為企業(yè)自制，應(yīng)提供其詳細(xì)制備過程；如主要原材料源于外購，應(yīng)提供資料包括：選擇該原材料的依據(jù)及對比篩選試驗資料、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢驗報告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗資料。生產(chǎn)商應(yīng)固定，不得隨意更換。

1.1引物和探針：microRNA長度短、序列相似度高，在引物/反轉(zhuǎn)錄引物、探針設(shè)計時應(yīng)充分考慮microRNA結(jié)構(gòu)特點。詳述靶標(biāo)或靶標(biāo)組合的選擇過程，對于多靶標(biāo)組合產(chǎn)品應(yīng)盡可能保持彼此間的差異性，提高探針的特異性。詳述引物和探針的設(shè)計原則，提供引物、探針核酸序列、靶序列的基因位點及兩者的對應(yīng)情況。反轉(zhuǎn)錄引物應(yīng)結(jié)合結(jié)構(gòu)圖（如莖環(huán)結(jié)構(gòu)），詳述各部位序列、作用及反轉(zhuǎn)錄過程中結(jié)構(gòu)變化等情況。通過篩選確定最佳的引物和探針組合。引物、探針的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)至少包括序列準(zhǔn)確性、純度、濃度及功能性實驗等。

1.2脫氧三磷酸核苷（dNTP）：包括dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP，應(yīng)提供對其純度、濃度、功能性等的詳細(xì)驗證資料。

1.3酶：需要的酶主要包括核糖核酸酶H（RNase H）、RNA依賴的DNA聚合酶、DNA依賴的DNA聚合酶、尿嘧啶DNA糖基化酶等，應(yīng)分別對酶活性、熱穩(wěn)定性、功能性等進(jìn)行評價和驗證。

1.4質(zhì)控品

試劑盒一般包含陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品。陽性質(zhì)控品應(yīng)包含試劑盒檢測的靶序列。質(zhì)控品需參與樣本處理、核酸的平行提取和檢測的全過程，以對整個提取和PCR擴增過程、試劑/設(shè)備、交叉污染等環(huán)節(jié)進(jìn)行合理質(zhì)量控制。提交試劑盒質(zhì)控品有關(guān)原料選擇、制備、定值過程、濃度范圍等試驗資料，對質(zhì)控品的檢測結(jié)果Ct值范圍做出明確的要求。如為多靶標(biāo)檢測產(chǎn)品，還應(yīng)對綜合計算后的結(jié)果范圍做出明確的要求。

1.5內(nèi)標(biāo)

內(nèi)標(biāo)，又稱內(nèi)對照，可對檢驗過程進(jìn)行質(zhì)量控制，應(yīng)與靶核酸一同提取及擴增。應(yīng)詳述內(nèi)標(biāo)基因的選擇。申請人需對內(nèi)標(biāo)的引物、探針設(shè)計和相關(guān)反應(yīng)體系的濃度做精確驗證，既要保證內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯的陽性曲線又要盡量降低對靶基因檢測造成的抑制。明確內(nèi)標(biāo)的檢測結(jié)果Ct值范圍。建議科學(xué)設(shè)置內(nèi)標(biāo)，對待測樣本的取樣質(zhì)量、試劑的反應(yīng)體系進(jìn)行監(jiān)控。

1.6核酸擴增反應(yīng)液（如適用）

如申請人選擇包含多組分的商用核酸擴增反應(yīng)液，應(yīng)提交不同商用核酸擴增反應(yīng)液的選擇、驗證研究資料，并明確核酸擴增反應(yīng)液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1.7 其他

試劑盒中其他生物活性物質(zhì)，如RNA酶抑制劑、DNA去除劑等，應(yīng)分別明確其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并進(jìn)行驗證。

1.8企業(yè)參考品制備

申請人應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品性能驗證的實際情況自行設(shè)定企業(yè)內(nèi)部參考品，包括陽性參考品、陰性參考品、檢出限參考品、精密度參考品。參考品可采用臨床樣本、細(xì)胞系，基質(zhì)一般為真實糞便樣本。如特定低濃度的樣本難以獲得，可采用不同濃度的樣本及陰性樣本進(jìn)行混合研究；必要時，如使用人工基質(zhì)進(jìn)行稀釋，應(yīng)考慮其基質(zhì)效應(yīng)。應(yīng)提交企業(yè)參考品的原料來源、選擇、制備、陰陽性及濃度確認(rèn)方法或試劑等相關(guān)驗證資料。

陽性參考品應(yīng)包含不同濃度水平靶基因的結(jié)直腸癌糞便樣本。

陰性參考品應(yīng)包含易發(fā)生交叉反應(yīng)的其他良惡性疾病糞便樣本及干擾物質(zhì)、待測靶標(biāo)序列相似的microRNA。

檢出限參考品應(yīng)包含所有靶基因檢出限水平或略高于檢出限的水平。

精密度參考品應(yīng)選擇代表性靶基因，并包括高、低兩個濃度的樣本，低濃度應(yīng)為陽性判斷值對應(yīng)的靶基因濃度。

2.生產(chǎn)工藝研究資料

介紹產(chǎn)品主要生產(chǎn)工藝，可用流程圖結(jié)合文字的方式表述。提交主要生產(chǎn)工藝的確定及優(yōu)化研究資料。